锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)
研究表明细胞中存在两种清除ROS的抗氧化系统，一种是酶抗氧化系统，包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)等;另一类是非酶抗氧化系统，包括麦角硫因、维生素C、维生素E、谷胱甘肽、褪黑素、α-硫辛酸、类胡萝卜素、微量元素铜、锌、硒(Se)等［2］。SOD作为酶抗氧化系统的重要一员，是细胞内抗氧化的第一道防线。其中MnSOD位于线粒体中，它通过歧化反应将O·2解毒以保护细胞免受线粒体ＲOS的损伤。因而，MnSOD对维持细胞氧化还原平衡非常重要。Mn-SOD蛋白质表达及酶活性对线粒体功能乃至细胞生理活性均产生重要影响，并与衰老及癌症等疾病密切相关［3］。
一、锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)生物学特性
SOD家族是一系列能清除超氧阴离子自由基的金属酶，具有抗氧化的功能，能够通过歧化反应催化超氧化物转化为O2和H2O2使暴露于氧化应激中的细胞免受氧化损伤。在真核生物体内有3种SOD，即存在于线粒体基质中的含锰超氧化物歧化酶(manganese-containingsuperoxidedismutase，Mn-SOD)和存在于细胞浆中或被分泌到细胞外液中的铜锌超氧化物歧化酶(copper-zinccontainingsuperox-idedismutase，CuZnSOD或SOD1)以及细胞外超氧化物歧化酶(extracellularsuperoxidedismutase，ec-SOD或SOD3)。三者的主要区别是所结合的金属辅助因子以及细胞定位不同［4］。
Mn-SOD由核基因编码，在细胞质中转录形成一个较大的前体，再借助其信号肽与位于线粒体膜的运输刺激因子结合，经过线粒体加工去掉N端的前导信号肽后成为成熟的蛋白质，最后以同源四聚体的活性形式定位于线粒体基质内［5］。MnSOD是一个高度可诱导的应激反应型基因，其基因结构包含三个重要的调控区域:与转录起始位点相邻的富含GC的启动子，第二内含子的增强子(～1900bp)和在真核生物中高度保守的上游调控元件(～800～1500bp)［6］。这三个调控区域可以动态地调节各种转录因子、炎性因子及药物诱导时基因表达。近年来，还发现Mn-SOD基因的表达受到表观遗传因素的调控。除此之外，MnSOD表达产物还需要经过选择性修饰以及分选定位，才能发挥功能。例如，当缺乏线粒体定位序列时，表达的多肽无法进入线粒体并以无活性的状态在细胞质中积累［7］。
二、锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)基因表达及活性调控
(一)转录调控
分析发现，Mn-SOD基因启动子区存在与转录诱导因子如Sp1;AP-2;NF-κB;CＲEB(cAMP敏感的元件结合蛋白);FoxOs等转录因子结合序列，同时在Mn-SOD基因5＇端还存在早期生长应答蛋白1(Egr-1)反应元件和TPA应答元件(TRE)等诱导性反应元件，这些序列元件可能在Mn-SOD基因表达调节中发挥着重要的作用。Sp1是人体细胞中广泛存在的转录调控因子，属于Sp/KLF锌指家族，通常作为主要的GC盒转录激活因子参与调控靶基因的表达。
研究发现，Sp1是Mn-SOD基因转录所必需的正调节转录因子，Sp1在Mn-SOD基因启动子区的结合是Mn-SOD高效转录所必须的，当Sp1结合位点发生缺失或突变均可导致Mn-SOD基因转录的下调［8］。胶质母细胞瘤(GBM)在抗癌药物替莫唑胺(TMZ)治疗中产生耐药性，研究发现在TMZ抗性的GBM细胞中Sp1出现过表达，使Sp1与Mn-SOD基因启动子区域结合增多，上调了Mn-SOD的表达从而保护GBM细胞免受TMZ诱导的细胞毒性［9］。AP-2是是一种核转录因子，其结合序列也富含GC盒，因为受Sp1调节的启动子中均含有AP-2结合位点，因此AP-2可以通过与Sp1竞争结合位点抑制转录。关于AP-2调节Mn-SOD基因转录的机制研究认为，由于AP-2与Mn-SOD的DNA的结合能力比Sp1强，AP-2可能与正调节转录因子Sp1竞争结合位点，从而抑制Mn-SOD基因的转录［10］。
另外，Spl与AP-2的比值决定基因的转录。硒处理降低原代培养肝细胞中AP-2的DNA结合活性，而对Sp1的DNA结合活性无影响，启动子区Sp1与AP-2的比值升高，Mn-SOD转录上调。癌细胞中高水平表达的Mn-SOD则与高水平表达的Sp1和低水平表达的AP-2相关［11］。P53会在转录后被激活，通过转录调节，对Mn-SOD的生成产生重大影响。Dhar等［12］使用7，12-二甲基苯(α)蒽(DMBA)/12-O-十四烷酰佛波醇-13乙酸(TPA)诱导多级皮肤癌发生小鼠模型中，发现被诱导表达的P53阻碍了Sp1进入MnSOD基因启动子的结合位点，从而抑制了MnSOD的表达。
另外，早期生长反应蛋白1(Egr-1)是核转录因子，其在调节细胞生长，分化，细胞存活和免疫应答中起重要作用。Porntadavity等［13］在人肝癌细胞系HepG2中鉴定了Egr-1在MnSOD启动子区域有结合位点，并发现了Egr-1的过表达Mn-SOD的表达有显著下调，证明了Egr-1对MnSOD的转录具有负调控作用。NF-κB参与调节各种刺激诱导的细胞MnSOD表达，包括辐射，含巯基药物和肿瘤坏死因子α(TNF-α)［14］。
Sompol等［15］证明TNF-α可以激活神经元细胞SH-SY5Y细胞中的NF-κB活性，并且优先增强p50和p65与MnSOD基因的启动子/增强子区域的结合，诱导Mn-SODmＲNA和蛋白质水平的表达，从而保护神经元免受氧化应激损伤。CCAAT增强子结合蛋白-β(C/EBPβ)是许多细胞内进程的关键调节剂。将C/EBPβ缺陷型成纤维细胞暴露于TNF-α会导致其由于细胞凋亡而死亡。
Ｒanjan等［16］发现在C/EBPβ缺陷细胞中，Bad、Bcl-2、Bcl-x、CAS和hILP/XIAP的表达以及NF-κB的核转位正常，但是没有诱导MnSOD的表达。补充C/EBPβ的C/EBPβ缺陷型细胞能够响应TNF-α诱导Mn-SOD的生成，排除C/EBPβ是通过调节早期凋亡基因表达或NF-κBp65表达来保护细胞的可能性，表明C/EBPβ通过上调Mn-SOD的表达，阻止TNF-α诱导的细胞死亡。缺氧诱导因子1α(HIF-1α)是HIF-1的氧敏感性亚基，是细胞应对缺氧条件的主要转录因子。Mn-SOD表达下调导致超氧自由基的歧化减少，可以使得低氧下HIF-1α稳定表达。
Gao等［17］发现，由肿瘤抑制因子pVHL缺陷和低氧处理引起的低氧条件下提高HIF-1α的表达会显著降低了Mn-SOD的表达。在两种情况造成的低氧条件下，转染了特异性沉默HIF-1α的shＲNA能恢复Mn-SOD的表达。用荧光素酶报告基因检测和染色质免疫沉淀实验进一步分析发现，HIF-1α能直接结合Mn-SOD启动子中的低氧反应元件抑制Mn-SOD的表达。FUS是一种多功能的DNA/ＲNA结合蛋白，具有ＲNA剪接，ＲNA转运，DNA修复、翻译和转录等功能。Dhar等［18］证明FUS是调节Mn-SOD表达的转录复合物的组成部分。FUS的过表达可以以剂量增加Mn-SOD表达，而通过siＲNA敲低FUS会抑制Mn-SOD基因转录。通过染色质免疫沉淀实验、电泳迁移率变化实验、亲和层析和表面等离子体共振分析揭示了FUS与SP-1在Mn-SOD启动子的上游区域结合调控Mn-SOD的表达。
(二)表观遗传调控
表观遗传学指在基因的DNA序列没有发生改变的情况下，基因功能发生了可遗传的变化，并最终导致了表型的变化。表观遗传调控基因表达的机制主要有DNA甲基化，组蛋白修饰和非编码ＲNA调控等。
Hodge等［19］发现在人类多发性骨髓瘤细胞系KAS6/1中，编码锰超氧化物歧化酶的Mn-SOD基因由于启动子超甲基化而在表观遗传学上沉默。用DNA甲基转移酶抑制剂Zebularine逆转启动子甲基化，可以增加Mn-SOD基因表达和酶水平。另外，乳腺癌细胞UACC-893或MDA-MB-435中Mn-SOD启动子区域存在高水平的CpG甲基化，使环磷腺苷效应元件结合蛋白(CＲEB)结合同源位点受到抑制，导致癌细胞中Mn-SODmＲNA表达水平低于非致瘤性乳腺上皮细胞系MCF-10A(2～3倍)。而DNA甲基转移酶抑制剂5-氮-2＇-脱氧胞苷增加乳腺癌细胞中的Mn-SODmＲNA、蛋白质的表达量和活性，进一步表明胞嘧啶甲基化会造成Mn-SOD转录水平的表观遗传沉默。大量研究证实CpG二核苷酸簇(CpG岛)是大多数基因的调控区域，在CpG岛胞嘧啶残基上添加甲基通常与转录抑制相关［20］。
组蛋白的甲基化可以发生在赖氨酸和精氨酸残基上，从而调节基因的表达。组蛋白3的第4位赖氨酸(H3K4)发生甲基化通常与基因激活有关，而组蛋白3的第9位赖氨酸(H3K9)发生甲基化与基因抑制相关。Qing等发现糖尿病模型鼠，Mn-SOD的表达赖氨酸特异的组蛋白去甲基化酶1(LSD1)跟同样年龄的正常鼠相比，LSD1的酶活增加了50%，而表达量提高了接近两倍。模型鼠的视网膜内皮细胞相对于正常细胞在Mn-SOD启动子和增强子区域有更多的LSD1，LSD1减少了Mn-SOD启动子和增强子区域H3K4的甲基化，使得H3K4me1和H3K4me2减少，Mn-SOD的蛋白表达受到抑制。同时LSD1在Mn-SOD启动子区域与Sp1结合增加，使得启动子区域的甲基化的H3K4发生去甲基化，使得染色质结构固缩，抑制启动子区域的Sp1和增强子区域的NF-κB协同调节Mn-SOD的表达［21］。
组蛋白乙酰化通常与可获得的染色质结构和转录激活有关。Hitchler等［22］发现Mn-SOD在乳腺癌细胞系中的表达下降与转录调控元件上的H3K9的低乙酰化和H3K4的低甲基化相关。乳腺癌细胞系中H3K9的低乙酰化和H3K4的低甲基化引起Mn-SOD基因的染色质呈固缩状态，从而使得NF-κB，AP-1和SP-1与Mn-SOD基因的结合降低。而组蛋白脱乙酰酶抑制剂可以激活Mn-SOD基因转录。微小ＲNA(miＲNA)通过结合靶mＲNA的3＇非翻译区(3＇-UTＲ)，致使靶mＲNA降解或翻译抑制。Duboisderuy和Cuvelliez在大鼠心肌梗死模型中鉴定出3个靶向调节Mn-SOD表达的miＲNAs(miＲ-21-5p、miＲ-23a-3p和miＲ-222-3p)。发现这3种miＲ-NAs表达升高是心肌梗死组织中Mn-SOD蛋白水平降低的重要原因。
Zhang等［23］实验室发现miＲ-140-5p在肺动脉高压(PAH)患者和PAH实验模型中发现下调，并抑制体外缺氧介导的肺动脉平滑肌细胞(PASMC)增殖。并证实miＲ-140-5p直接靶向Dn-mt1，抑制Dnmt1的表达，解除了Mn-SOD启动子内的CpG岛过度甲基化，从而上调Mn-SOD的表达。
(三)Mn-SOD翻译后修饰的调控
尽管Mn-SOD主要受到转录水平的调节，但翻译后修饰在调节Mn-SOD活性、相互作用和定位中也起重要作用。研究发现了Mn-SOD的几种翻译后修饰，包括磷酸化、硝化和乙酰化等。细胞周期依赖性激酶Cdk1及其调控伴侣Cy-clinB1在调节细胞周期进程以及基因毒性应激反应中发挥重要作用。
Candas等［24］确定了人类Mn-SOD多肽中最小Cdk1磷酸化共有序列(S/T］-P，Ser106)的存在，表明Cdk1是潜在的Mn-SOD上游激酶。随后他们在辐射的人正常细胞、癌细胞以及小鼠组织细胞中均检测到Cdk1/Mn-SOD复合物和磷酸化的Mn-SOD含量增多。CyclinB1/Cdk1可以可逆的磷酸化Mn-SOD多肽丝氨酸106位(Ser106)位点，从而提高Mn-SOD的活性和稳定性，以及改善的线粒体功能和细胞对辐射诱导的细胞凋亡的抗性。一氧化氮分子(NO)是一种普遍存在的细胞信使。NO的病理效应与活性氮(ＲNS)的产生有关，例如NO和氧气反应生成氮氧化物(NOX)，以及与超氧化物反应生成过氧化亚硝酸盐(ONOO)。其中，过氧亚硝酸盐是生物相关的硝化剂。
Ｒedondo等［25］研究发现环孢素A(CsA)能靶向的诱导Mn-SOD发生硝化，进而检测到内皮细胞暴露于CSA过程中产生活性氧和过氧化亚硝酸盐，并确定产生的过氧亚硝酸盐使Mn-SOD酶活性关键位点34位的酪氨酸残基发生硝化作用，导致Mn-SOD酶失活。沉默信息调节子同源蛋白3(Sirt3)是Sirtuins脱乙酰基酶家族中的一员。是线粒体主要的蛋白脱乙酰酶。
Chen等［26］研究发现细胞缺乏Sirt3时，Mn-SOD的活性会有所降低，这似乎意味着Mn-SOD的活性与Sirt3的水平有关。Tao等［27］发现Mn-SOD的蛋白的122位赖氨酸容易被Sirt3催化去乙酰化，导致Mn-SOD酶活性增加。对于Mn-SOD赖氨酸68位也显示了类似的结果，Mn-SOD的蛋白在赖氨酸68处被乙酰化，则其活性降低。提示Mn-SOD可能有多个赖氨酸乙酰化位点共同决定其活性。
三、锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)与肿瘤发生发展的关系
研究发现，Mn-SOD在肿瘤细胞中的表达水平体现显著的差异性，同时与肿瘤细胞的增殖、转移特征具有显著的相关性。1979年，Oberley等［28］首先总结了Mn-SOD表达在肿瘤细胞中的作用，认为Mn-SOD是一种新的肿瘤抑制因子。研究发现Mn-SOD在乳腺，食道和胰腺癌中表达下降，然而在另外一些类型的肿瘤如卵巢癌、甲状腺癌、食道癌、胃癌和结肠直肠癌中Mn-SOD蛋白表达水平上调，恶性间皮瘤中Mn-SOD基因表达也增强，研究推测这是由于一些细胞因子如IL1、TNF-α等激活了Mn-SOD的表达。Mn-SOD在肿瘤细胞中的表达水平不仅和肿瘤类型相关，而且与肿瘤发展时期有关。在一些早期的肿瘤中Mn-SOD的表达较低，而晚期肿瘤，特别是某些转移型的晚期肿瘤中Mn-SOD的表达水平普遍偏高［29］。
在早期肿瘤细胞中Mn-SOD的低表达能够促进细胞的生长增殖，而Mn-SOD的高表达有助于肿瘤细胞的迁移侵袭。在TPA诱导的小鼠皮肤皮肤癌的研究中发现，p53和Sp1通过对Mn-SOD的表达调控在早期成瘤、转化以及入侵等环节发挥了重要作用。在早期致瘤阶段，致癌物活化了p53，并与Sp1在Mn-SOD转录结合区形成竞争性抑制，使得Mn-SOD的表达量下调，这有利于细胞线粒体中ＲOS增加，并使细胞处于高氧化的环境，从而造成DNA损伤激活癌基因促进肿瘤的产生。早期乳头状瘤中，虽然发现NF-κB与Sp1的结合活性显著提高，但是由于Sp1与启动子结合减少，Mn-SOD的表达出现持续抑制，产生了高氧化应激环境。
在鳞癌中，虽然NF-κB的结合活性被显着抑制，但是由于p53失活，恢复了Sp1与Mn-SOD基因启动子的结合活性，增加了Mn-SOD转录，使恶性肿瘤细胞更有效地对抗增加的氧化应激，从而赋予它们生长优势。将p53用siＲNA敲除后，体外肿瘤侵袭实验发现抑制p53会导致Sp1结合增加，Mn-SOD表达升高促进了肿瘤细胞的入侵。将p53用siＲNA敲除的基础上使Sp1功能的丧失，则加剧了p53敲除导致的细胞转化，但不促进肿瘤细胞的入侵［30］。
四、结语
Mn-SOD是线粒体内主要的抗氧化酶，参与细胞生理活动调节。多种转录因子、细胞因子及表观遗传学因素等参与Mn-SOD基因的表达调控，磷酸化、硝基化及乙酰化等翻译后修饰过程则对Mn-SOD蛋白质活性进行调节。Mn-SOD表达水平与肿瘤增殖、转移及恶性程度有密切联系，但是机制研究还尚少。进一步研究肿瘤细胞中Mn-SOD表达与活性调控机制，将有利于更全面地揭示肿瘤发生发展的分子机制，有利于获得肿瘤诊断与治疗的新型有效靶点分子。
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